HPLC tanımı, İngilizce “High liquid pressure chromatography” kelimelerinin baş harflerinin birleştirilmesi ile oluşan bir kısaltmadır. HPLC, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisinin kısaltmasıdır. “Kromatografi” bir ayırma tekniğidir, “kromatogram” kromatografinin sonucudur ve “kromatograf” kromatografi yapmak için kullanılan araçtır.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) bir sıvıda çözünmüş bileşenlerin, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile değişik etkileşimlere girmesi, kolon içinde değişik hızlarla hareket etmeleri sonucu, farklı zamanlarda bileşenlerin kolonu terk ederek birbirlerinden ayrılması temeline dayanır. Sağlık, tarım, sanayi gibi birçok değişik alanda çeşitli kullanım yöntemleri olan kromatografinin en önemli, yaygın ve etkin olan Likit Kromatografi temelli HPLC ve LC-MS/MS cihazlarıdır. Bu cihazlardan HPLC maddeleri kolondan çıkış zamanlarına göre analiz etmektedir. Sıklıkla kullanılan diğer yöntem olan LC-MS/MS ise molekülleri hem kütle-yük oranlarına göre hem de kolondan çıkış zamanlarına göre analiz etmektedir.

Kromatografi Temelinde Bilinmesi Gereken Terimler Nelerdir?

Mobil Faz: Analiz için bir sıvı numunedeki bileşenleri ayırmak için kullanılan çözücüye mobil faz nedir. Mobil faz, sabit faz olarak bilinen bir ayırma kolonuna ve ardından çözücü dağıtım pompası tarafından kontrol edilen sabit bir akış hızında detektöre iletilir.

Sabit Faz: Mobil faz içerisinde gelen numuneye ait bileşenlerin etkileşime girdikleri ve belirli ölçüde alıkonuldukları fazdır. Sabit fazın bir diğer bilinen adı ise kolondur.

Alıkonma: Analitin kromatografik kolon üzerindeki kalıcılığını ölçmek için kullanılan parametredir. Alı konma durumunu, maddenin yapısı, sabit faz ve hareketli fazın türü belirlemektedir.

Kromatografik Yöntemlerin Sınıflandırılması

A. Hareketli Fazın Tiplerine Göre;

Sıvı Kromatografisi (LC)

Gaz Kromatografisi (GC)

Süper Kritik Akışkan Kromatografisi (SFC)

B. Uygulama Biçimine Göre;

Kâğıt Kromatografisi

İnce Tabaka Kromatografisi (İTK)

Sütun Kolon Kromatografisi (CC)

Gaz Kromatografisi (GC)

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)

C. Ayrım Mekanizmalarına Göre;

Adsorpsiyon kromatografisi

Dağılma (Partisyon) kromatografisi

İyon değiştirme kromatografisi

Moleküler eleme kromatografisi (Jel krom.)

Afinite kromatografisi (Kimyasal krom.)

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi Bileşenleri

HPLC sistemi esas olarak bir infüzyon pompası, bir örnekleyici, bir kromatografik kolon, bir dedektör ve bir veri kayıt ve işleme cihazından oluşur. Bun lar arasında infüzyon pompası, kromatografik kolon ve dedektör temel bileşenlerdir. Ek olarak, gradyan elüsyon cihazı, çevrimiçi gaz giderici, otomatik örnekleyici, ön kolon veya koruma kolonu ve kolon sıcaklık kontrolü de gerektiği gibi yapılandırılabilir. Modern HPLC cihazları, otomatik cihaz kontrolü ve veri işleme için bir mikrobilgisayar kontrol sistemi ne sahiptir.

1. İnfüzyon Sistemi: İnfüzyon pompaları, sabit çıkış sıvısı faktörlerine göre sabit basınç pompaları ve sabit akış pompaları olarak sınıflandırılır.

2. Gradyan Denetleyici: Bazı durumlarda, mobil fazın bileşimini zaman içinde değiştirmek için bir gradyan denetleyici kullanılır. Bu, analiz sırasında çözücü kuvvetini ayarlayarak ayırmanın optimize edilmesini sağlar.

3. Pompa: Pompa, mobil fazı çözücü haznesinden sistemin geri kalanına sabit bir akış hızında iletir. Sistemde, numune ve fazımızın enjektör, kolon ve dedektör boyunca sürekli sabit akışını sağlayan kısımdır. Yüksek basınç altında çalışabilmesi, basınç dalgalanmasının düşük olması, akış doğruluğu ve tekrarlanabilirliği, kendi üzerinden kumanda edilebilme olanağı bir pompa sisteminde olması gereken temel özelliklerdir.

4. Enjektör: Enjektör, mobil faz akışına küçük bir hacimde numune sokar.

5. Kolon: Ayırma işleminin gerçekleştiği yerdir.

6. Dedektör: Analitlerin ayrılması kolonun içinde gerçekleşir ve ayırma bir dedektör kullanılarak görülür.

7. Veri Toplama: Sistem, numune ayırma, hazırlama veya tanımlamanın doğru bir şekilde gerçekleştirilebilmesi için test verilerini toplayabilir, depolayabilir, görüntüleyebilir, yazdırabilir ve işleyebilir.

HPLC Cihazının Önemli Ve Gözden Kaçan Bileşenleri

• Mobil Faz Gaz Giderici: HPLC cihazlarında mobil faz gaz giderici, mobil faz olarak kullanılan sıvıların, özellikle çözgenin içindeki çözünmüş gazları uzaklaştırmak amacıyla kullanılan bileşendir. Gazların giderilmesi, daha stabil bir akış ve daha doğru analizler yapılmasını sağlar.

• Kontrol Vanaları: HPLC cihazlarında kontrol vanaları, sistemin çeşitli işlevlerini düzenleyen ve yönlendiren, sıvı akışını kontrol etmek amacıyla kullanılan bileşenlerdir. Bu vanalar, özellikle mobil fazın, akışını yönlendirmek, mobil fazın bileşenlerini değiştirmek veya sıvıların belirli hatlara yönlendirilmesini sağlamak için kullanılır.

• Akış Hücresi: HPLC sistemlerinde, örneğin dedektör kısmında bulunan ve akışkanın geçiş yaptığı bir bileşendir. Bu hücre, genellikle dedektörle bağlantılıdır ve burada mobil fazın içindeki bileşiklerin analiz edilmesi için kullanılır.

• Örnek Filtrasyonu: HPLC analizine başlamadan önce örneğin içindeki katı partiküllerin uzaklaştırılması işlemi olarak tanımlanabilir. Bu, örneğin kolon tıkanmasını engellemek, basıncı düzenlemek ve dedektör yanıtlarını optimize etmek amacıyla yapılır.

• Kolon Fırını: Kromatografik analizlerde kullanılan önemli bir bileşendir. Kolponun stabil bir sıcaklıkta tutulmasına yardımcı olur. Kolon fırını, analizlerin doğruluğunu, tutarlılığını ve verimliliğini artıran bir parçadır ve özellikle sıcaklık duyarlı bileşiklerin ayrılmasında önemli rol oynamaktadır.

• Basınç Tahliye Vanası: Sistemdeki fazla basıncı düzenler ve olası basınç artışlarının önüne ge çer. Bu vana yalnızca sistemin uzun ömürlü olmasını sağlamakla kalmaz, aynı zamanda doğru ve güvenilir analiz sonuçları elde edilmesine de olanak tanır.

• Atık Yönetim Sistemi: Analizlerde kullanılan ve analiz sırasında oluşan atıkların güvenli bir şekilde toplanması, depolanması ve bertaraf edilmesi için tasarlanmış bir sistemdir. Analiz sürecinde kullanılan çözücüler, reaktifler ve örnekler genellikle kimyasal olarak tehlikeli olabilir ve çevreye zarar vermemek için doğru bir şekilde işlenmesi gerekir.

• Kolon Bağlantı Parçası: HPLC sisteminin doğru çalışabilmesi için kritik bir bileşendir. Kolonun diğer sistem bileşenlerine güvenli, sızdırmaz ve kimyasal dayanıklı bir şekilde bağlanmasını sağlar. Bu, analizlerin doğruluğunu, güvenliğini ve verimliliğini artırır, ayrıca bakım ve değişim süreçlerini kolaylaştırır.

HPLC Kullanım Alanları

• İlaç Endüstrisi: İlaçların saflığını, aktif bileşenlerini ve safsızlıklarını belirlemek için kullanılır. İlaçların stabilite testleri ve farmasötik formülasyonların analizinde yaygın olarak kullanılır.

• Kimya Endüstrisi: Organik bileşiklerin saflaştırılması ve analizi için kullanılır. Polimerlerin analizi, bileşiklerin tanımlanması ve saflaştırılması gibi işlemler için önemlidir.

• Gıda ve İçecek Analizi: Gıda bileşenlerinin analizinde kullanılır.

• Çevre Bilimleri: Atık su ve çevre örneklerinde toksit bileşiklerin tespiti yapılabilir.

• Biyokimya ve Moleküler Biyoloji

• Klinik ve Tıbbi Uygulamalar: Kan plazması, idrar, serum gibi biyolojik örneklerde ilaç düzeylerinin ve metabolitlerinin ölçülmesinde kullanılır. Üretim süreçlerinin kalite kontrolü ve hatalı ürünlerin tespitinde önemli yer tutar.

• Kimyasal Saflık ve Kalite Kontrolü: Kimyasal maddelerin ve ürünlerin saf olma derecelerinin belirlenmesinde kullanılır. Üretim süreçlerinin kalite kontrolü ve hatalı ürünlerin tespitinde önemli bir yer tutar.